Phù Sinh Lục Ký Bl

Địa chỉ: 2 Ngô Đức Kế #20 Mê Linh Point - Phường Bến Nghé - Quận 1 - TP Hồ Chí Minh

Ưu điểm và nhược điểm của Sắc ký lớp mỏng và Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng và Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong phân tích. Cho nhiều đối tượng thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau. Ưu điểm của chúng là:

Bên cạnh đó phương pháp Sắc ký lớp mỏng cũng có những nhược điểm như:

Ứng dụng sắc ký lớp mỏng trong kiểm nghiệm thuốc

Sắc ký lớp mỏng cùng với sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là hai phương pháp được áp dụng nhiều trong phân tích của ngành dược phẩm, hóa học lâm sàng, hóa học pháp y, hóa sinh. Một số ngành khác như mỹ phẩm, phân tích thực phẩm, phân tích môi trường.

Trong kiểm nghiệm thuốc Sắc ký lớp mỏng được sử để theo dõi quá trình phản ứng của tổng hợp thuốc. Định tính và xác định độ tinh khiết của nguyên liệu, thành phẩm thuốc. HPTLC với hệ thống trang thiết bị đồng bộ, độ chính xác cao cho phép định tính và cả định lượng để tiêu chuẩn hóa thuốc nguyên liệu và thành phẩm.

Nguyên liệu và các thành phẩm thuốc có nền mẫu tương đối đơn giản. Hơn nữa qui trình phân tích bằng sắc ký lớp mỏng trong Dược điển đã ổn định. Do đó TLC được sử dụng trong hầu hết các phép thử định tính của đối tượng này. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao rất ít khi được dùng để định tính thành phẩm thuốc hóa dược. Nguyên tắc định tính bằng sắc ký lớp mỏng, mẫu thử được thực hiện song song với mẫu chuẩn và so sánh khoảng cách (R) chúng di chuyển với khoảng cách của chất đối chiếu đã biết. Màu sắc vết trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử phải được thực hiện song song, nếu trùng nhau thì được coi là dương tính.

Đối với phép sắc ký thực hiện trên hệ thống Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có bộ phận quét phổ (scanner), còn có thể tiến hành quét phổ hấp thụ UV – Vis tại vị trí vết chất phân tích trên sắc ký đồ để định tính. Khi định tính bằng HPLC – DAD, bộ phận scanner vừa có khả năng quét phổ trong vùng UV – Vis, đồng thời có thể thực hiện chồng phổ của vết chất phân tích.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có ưu điểm hơn với sắc ký lớp mỏng là có thể tách riêng chất phân tích ra khỏi các chất khác trong hỗn hợp với độ chọn lọc cao. Do đó một số dược điển như USP yêu cầu định tính sử dụng bản mỏng HPTLC.

Định danh tạp chất đã biết được xác định dựa vào so sánh với Rf của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng. Khi đánh giá kết quả thường là phép thử giới hạn cũng có thể là định lượng. Đánh giá kết quả căn cứ vào đậm độ về màu sắc của vết chất phân tích tách ra trên sắc đồ. Đối với sắc ký lớp mỏng cường độ vết được phát hiện bằng mắt. Còn trong sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, vết chất phân tích được chuyển thành dạng pic với thông số diện tích hoặc chiều cao pic tương tự HPLC. Sắc ký đồ chuyển từ dạng vết sang dạng pic trong sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được gọi là sắc ký đồ dạng pic hay sắc ký đồ analog.

Để xác định giới hạn tạp chất bằng sắc ký lớp mỏng thường thực hiện theo 2 cách như sau:

Yêu cầu phép phân tích là phải phát hiện được vết trong sắc ký đồ. Do đó, thường so sánh cường độ vết thu được của dung dịch mẫu thử với dung dịch pha loãng của chất kiểm tra. Mẫu thử được chuẩn bị ở mức nồng độ cao, mẫu đối chiếu sẽ được pha loãng với mẫu thử đến mức giới hạn (mẫu đối chiếu cũng có thể mẫu pha từ chất chuẩn ở mức nồng độ giới hạn). Mẫu thử được phân tích ở nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả các tạp. Mẫu đối chiếu ở nồng độ thấp nhằm đảm bảo độ tuyển tính của hoạt chất. Đáp ứng của hoạt chất có trong mẫu có nồng độ thấp tương tự tạp chất liên quan có nồng độ cao.

Một số thuốc thử tạo dẫn xuất trong phân tích dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng :

Nồng độ các tạp chất được xác định dựa trên cường độ vết của tạp trong mẫu thử  và đáp ứng của chuẩn tạp tương ứng. Thông thường, nồng độ dung dịch chuẩn tạp được chuẩn bị ở mức giới hạn cho phép của tạp đó. Khi tiến hành xác định tạp chất, cần chú ý đến độ nhạy của phương pháp và khả năng tách của hệ thống.

Sắc ký lớp mỏng thường chỉ được ứng dụng trong định tính, hầu như không được sử dụng trong định lượng nói chung và đối tượng thuốc nói riêng.

Còn Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với những cải tiến nhằm tăng độ phân giải của quá trình tách, đảm bảo độ tái lặp cũng như độ đúng của phép thử cho phép ứng dụng rộng rãi trong phân tích định lượng các chất. Việc sử dụng các thiết bị hiện đại như: máy quét, máy đo mật độ vết. Điều kiện buồng sắc ký được kiểm soát, chất hấp phụ đa dạng về chủng loại có độ phân giải cao. Kích thước hạt nhỏ và đồng đều, khả năng kết nối với các thiết bị phát hiện khác nhau. Cùng với sự phát triển của các chương trình phần mềm để thu và xử lý số liệu giúp cho sắc ký lớp mỏng trở thành một phương pháp thay thế HPLC hoặc sắc ký khí.

Việc sử dụng Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được đánh giá cao và được chấp nhận trên toàn thế giới. Ngày càng có nhiều công bố các nghiên cứu sử dụng HPTLC trong định lượng thuốc đã được đăng tải. Bao gồm kiểm tra chất lượng trong quá trình sản xuất, theo dõi độ ổn định, thậm chí trong lâm sàng.

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và hiệu quả. Do đó được ứng dụng rộng rãi phân tích nhiều loại đối tượng mẫu khác nhau. Qua thời gian, nó đã chứng minh được độ tin cậy của kết quả thử nghiệm và được công nhận là phương pháp thường qui để định tính, thử tinh khiết trong kiểm nghiệm thuốc hóa dược, dược liệu.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là một dạng sắc ký lớp mỏng tiên tiến nhất với việc sử dụng pha tĩnh có hiệu quả phân tách tối đa. Thiết bị đo đạc hiện đại cho tất cả các bước trong qui trình phân tích. Cho phép giải quyết tất cả các yêu cầu phân tích bao gồm định tính, thử tinh khiết và định lượng phù hợp với các chuẩn mực qui định về phương pháp phân tích như ICH, AOAC.

Để biết thêm thông tin về kỹ thuật liên hệ chúng tôi theo thông tin sau:

VP Hồ Chí Minh: 086 203 0022 – VP Hà Nội: 086 203 0011

Mail: [email protected]  – Website: www//hbcsci.com

Geiss, Friedrich. Fundamentals of thin layer chromatography planar chromatography. Heidelberg: A. Hüthig, 1987. Print.

Touchstone, Joseph C. Practice of thin layer chromatography. 3rd ed. New York: Wiley, 1992. Print.

Thiết bị và dụng cụ thực hiện Sắc ký lớp mỏng

Như đã đề cập trước đó, các bản TLC (hay còn được gọi là bản sắc ký) có thể được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm. Nhưng thường sẽ được chọn mua là nhiều nhất. Pha tĩnh phổ biến nhất là Silica gel và alumina, nhưng những loại khác cũng có sẵn.

Nhiều tấm kết hợp với một hợp chất phát huỳnh quang dưới tia cực tím bước sóng ngắn (254 nm). Mặt sau của các tấm TLC thường là thủy tinh, nhôm hoặc nhựa. Tấm kính cứng, trong suốt và có thể tái sử dụng có khả năng kháng hóa chất cao và ổn định nhiệt tốt khi đốt than. Vì những lý do này, chúng là tấm đỡ được sử dụng rộng rãi nhất.

Tấm lá nhôm là giải pháp thay thế hỗ trợ giúp dễ dàng xử lý và chống vỡ. Nhẹ và mỏng hơn tấm kính, tấm nhôm có thể giảm chi phí vận chuyển và tiết kiệm không gian lưu trữ. Ngoài ra, chúng có thể dễ dàng cắt bằng kéo theo kích thước mong muốn và dễ lưu trữ trong phòng thí nghiệm.

Các tấm đỡ bằng nhựa hoặc polyester (PET) cũng được sử dụng vì nhẹ và linh hoạt.

Bảng so sách bên dưới sẽ cung cấp các thông tin ưu và nhược điểm của các tấm TLC:

Tùy theo đặc tính của mẫu mà chúng ta chọn pha tĩnh phù hợp. Chúng tôi cung cấp nhiều lựa chọn các tấm TLC phân tích tiêu chuẩn.

HPTLC mang lại những lợi thế khác biệt hơn TLC. Như khả năng phân giải tốt hơn, thời gian phân tách nhanh, khuếch tán mẫu thấp hơn. Và giảm mức tiêu thụ dung môi. Các bản HPTLC có sẵn được phủ nhiều loại chất nền khác nhau và có hoặc không có chất chỉ thị. Bản sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) đặc trưng bởi các hạt nhỏ hơn 10 µm, các lớp mỏng nhỏ hơn 200 µm.

Chất kết dính không ảnh hưởng đến các đặc tính hấp phụ của ma trận. Nhưng chúng ảnh hưởng đến sự kết dính của lớp chất hấp phụ với lớp nền. Chất kết dính sẽ gồm:

Lựa chọn dung môi thích hợp có lẽ là khía cạnh quan trọng nhất của sắc ký lớp mỏng. Một dung môi phổ biến là 1:1 hexan:etyl axetat. Việc thay đổi tỷ lệ có thể có tác động rõ rệt đến giá trị Rf nằm trong khoảng từ 0 đến 1. Với 0 biểu thị độ phân cực của dung môi rất thấp. Và 1 biểu thị độ phân cực của dung môi rất cao.

Khi thực hiện thử nghiệm sắc ký lớp mỏng, bạn không muốn các giá trị của mình là 0 hoặc 1. Vì các thành phần mà bạn đang tách có các cực khác nhau. Nếu giá trị bằng 0, bạn cần tăng độ phân cực của dung môi. Vì mẫu không chuyển động và dính vào pha tĩnh. Nếu giá trị là 1, bạn cần giảm độ phân cực của dung môi vì hợp chất không thể tách rời.

Nếu bạn biết rằng một thành phần của hỗn hợp không hòa tan trong một dung môi nhất định. Nhưng một thành phần khác hòa tan tự do trong đó, thì nó thường cho phép phân tách tốt. Tốc độ các hợp chất di chuyển lên tấm phụ thuộc vào hai điều:

Thường tạo ra các vệt rõ hơn là các vết trong dung môi trung tính. Các vệt gây khó khăn cho việc tính (Rf) và thậm chí nó còn che lấp các điểm khác. Thêm một vài phần trăm axit axetic hoặc axit formic vào dung môi. Có thể khắc phục hiện tượng sọc bằng axit. Nước hiếm khi được sử dụng làm dung môi vì nó tạo ra mặt trước đường cong không đồng đều. Nguyên nhân là do sức căng bề mặt của nó.

Tương tự như vậy đối với bazơ, thêm một vài phần trăm triethylamine có thể cải thiện kết quả. Đối với các hợp chất phân cực, thêm một vài phần trăm metanol cũng có thể cải thiện kết quả.

Độ bay hơi của dung môi cũng cần được xem xét khi sử dụng. Bất kỳ dung môi nào còn lại trên đĩa cũng có thể gây ra các phản ứng . Nhiều dung môi có thể được loại bỏ bằng cách để yên trong vài phút, nhưng những dung môi rất khó bay hơi có thể cần thời gian trong buồng chân không. Dung môi dễ bay hơi chỉ nên được sử dụng một lần. Nếu pha động được sử dụng nhiều lần, kết quả sẽ không nhất quán hoặc không thể lặp lại. Hỗn hợp dung môi hữu ích:

Các điểm được chấm lên tấm TLC bằng cách sử dụng pipet thủy tinh rất mỏng. Mao quản phải đủ mỏng để thực một điểm gọn gàng. Nhưng không quá mỏng để ngăn cản sự hấp thu đủ lượng chất phân tích.

Chuẩn bị bình chạy sắc ký: Các bình thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ. Có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi vào khí quyển trong bình. Bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc. Còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Đậy kín nắp bình và để yên 1 h ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết. Loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ bị biến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp, phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi. Sẽ làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị sốRf.

Tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng theo các bước cơ bản sau:

Khi quá trình triển khai sắc ký lớp mỏng hoàn tất, cần phải có hình ảnh trực quan của các vết trên sắc ký đồ để phát hiện và đánh giá kết quả. Nhiều hợp chất có hấp thụ ánh sáng UV hoặc có đặc tính huỳnh quang khi bị kích thích bởi tia cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy thì có thể phát hiện trực tiếp. Nhưng hầu hết các hợp chất không có màu rõ ràng nên phải sử dụng thuốc thử thích hợp để hiện màu. Số lượng thuốc thử phát hiện khi phân tích bằng Sắc ký lớp mỏng rất lớn điều đó phản ánh tính linh hoạt của kỹ thuật phát hiện.

Iodine (Iốt)  là một trong những thuốc thử phổ biến nhất. Hầu hết các hợp chất hữu cơ sẽ bị nhuộm màu nâu tạm thời. Một số thuốc thử được sử dụng như là Permanganat, ceric ammonium molybdate (CAM) và p-anisaldehyde.